PCR實驗操作

 

    PCR是極為重要的DNA增殖技術，應用層面非常廣，其中包括了核酸探針的制備。如果一段DNA已經被次選殖至載體上，要以PCR擴增這段DNA時，可根據質體multiple cloning sites兩邊的序列，選用適當的核酸引子 （universal primers） 進行擴增反應；比較常用的引子包括SP6, T3 與T7 promoter primer, M13/pUCforward與reverse primers等；若有特殊考量，也可以使用序列專一性核酸引子對。進行PCR反應時若同時添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP，所增殖的DNA即被32P或DIG所標定，所以PCR是制備核酸探針非常便捷好用的方法。

 

    儀器用具：微量離心機；PCR 反應器

 

    藥品試劑：

    模版DNA： pBlueGus 質體DNA （~50 pg）

    核酸引子對： T3 promoter primer 與T7 promoter primer （各2 μM）

    礦物油 （是否需要視PCR反應器機型而定）

    PCR DIG probe synthesis kit （Roche）, 內含：

    Taq DNA polymerase （Expand High Fidelity, 3.5 U/μL）

    10×PCR DIG probe synthesis mix （2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP,及0.1 mM DIG-11-dUTP, pH 7.0）

    Expand high fidelity buffer with MgCl2 （10×）

 

    方法步驟：

    以下反應條件主要參照PCR DIG probe synthesis kit 制造廠商所提供的產品說明。

    1）  取一支0.5 mL微量離心管，依下表逐一加入各項試劑 （單位 μL）：

  

    2） 以手指頭輕彈管壁使各項試劑混合均勻。

    3） 短暫離心后，徐徐加入100 μL 礦物油。

    ◆ 有些PCR 反應器不需使用礦物油。

    4） 在PCR 反應器上設定PCR 反應條件：Denaturation： 94℃/10 min

    擴增反應：

     30 循環的 [94℃/45 s → 55℃/1 min → 72℃/2 min]

    zui后的elongation step：72℃/10 min

    5） 將微量離心管移至反應器上，并開始進行PCR 反應。

    6） 反應完成后，以微量移液器吸出礦物油，并取出5 μL PCR 反應產物，進行洋菜膠體電泳分析。