肉毒梭菌診斷技術(shù)

 

   （1）檢驗程序  檢驗菌株是否產(chǎn)生肉毒毒素，或污染食品中是否有產(chǎn)毒素的肉毒梭菌存可按圖進行檢驗。

 

檢樣接種肝湯35℃培養(yǎng)3天    檢樣接種TPCYT肉湯2℃培養(yǎng)5天

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取液體部分7000r/min離心30min

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取上清中過滅菌

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血清學試驗  禽眼瞼閉合試驗  小白鼠腹腔注射及中和試驗

    （2）檢驗方法

    ①毒素提取和濃縮。取引起中毒的食品、飼料以及病死動物的胃內(nèi)容物，用生理鹽水做成懸液或取培養(yǎng)液的濾液500ml，可加5％明礬水溶液2．5ml（或l％羥基氯化鋁5m1）。按一個方向輕輕攪拌5min，靜置至結(jié)絮，經(jīng)薄脫脂棉層過濾。用lo一15ml的水洗下結(jié)絮，以1000r／mir離心lmin（或待其自然沉降），棄去上清液收集絮凝物，用pH6．5的o．2％明膠緩沖液溶解絮疑物。若室溫超過25℃，應(yīng)在冰浴中處理標本，以免毒素活性降低。

    ②小白鼠腹腔接種法。取15～25g的小白鼠分成3組，每組2～3只。1組：腹腔接種被檢標本的稀釋液o．5mi；2組：腹腔接種經(jīng)沸水浴處理10min的被檢標本稀釋液o．5ml；3組：腹腔接種被檢標本與等量不同稀釋率的抗毒素混合液lml。觀察2～6h，之后早晚2次，共觀察4天。若1組的小鼠出現(xiàn)明顯腹壁震顫、縮陷、“失聲”（用鑷子夾尾巴時不能叫）、隨后呼吸困難、眼球突出、zui后死亡；而2組、3組小鼠仍然健活。這表明被檢標本中存在肉毒毒素。

    ③禽眼瞼閉合試驗。在投有小白鼠的情況下，可選用禽類（如雞、鴿子等），做眼瞼注射。接種量可視禽的大小選用，一般注射0.1～0.3ml。具體操作：用藍芯注射器從禽的內(nèi)眼角向下注射眼險皮下。注射后眼瞼隆起，幾分鐘后接種液被吸收，眼瞼復原。然后視注入液中的毒素含量多少，導致閉合時間的早晚不同，毒素含量越多閉眼越快。如注入含量為幾個小鼠致死量的毒素，一般可使試驗動物在1-l0h內(nèi)出現(xiàn)閉眼癥狀；如毒素量超過對禽體的致死量，則出現(xiàn)麻痹性癱瘓和呼吸困難等癥狀后經(jīng)幾十分鐘到幾小時死亡；如注射后20rain內(nèi)出現(xiàn)死亡，應(yīng)判斷為注射失敗。

    ④血清學試驗

    反向間接血凝試驗  用各型抗毒素致敏已固定、鞣化的人紅細胞。即可用于毒素檢測。本法可將毒素分型，且有較高的特異性和敏感性。

    對流免疫電泳  用pH8，6的巴比妥緩沖液配制1％的瓊脂糖凝膠鋪于7cm×10cm玻璃板上，打出相距6mm的兩列孔。其中一列分別加入被檢樣品稀釋液、標準毒素稀釋液20,uL；另一列加入抗毒素血清20uL。在60mA、6～8V/cm條件下電泳45-60min，觀察有無沉淀線出現(xiàn)。本法重復性好，但其敏感性不如反向間接血凝法。

 

    ELISA多用雙抗體夾心法檢測肉毒毒素

    其方法為在聚苯乙烯酶標反應(yīng)板上先加抗毒素血清包被過夜，洗滌后，加入待檢標本，37℃下孵育90min，再經(jīng)洗滌后加入兔的抗毒素血清，37℃孵育90min，再次洗滌后加入羊抗兔IgG-酶結(jié)合物，37℃孵育90min，洗滌后加入底物溶液，其他操作同ELISA常規(guī)法。

 

    人類肉毒中毒主要有3種類型。a食物性肉毒中毒。主要是由于進食了含有肉毒毒素的食品引起的，也是人類肉毒中毒的zui普遍的一種形式。b嬰兒肉毒中毒。由于新生兒正常腸道菌群缺乏，其食人的肉毒梭菌芽孢可以萌發(fā)、繁殖、產(chǎn)生毒素，從而引起嬰兒中毒。c創(chuàng)傷性肉毒中毒，類似于破傷風，由于傷口處污染的肉毒梭菌芽孢繁殖、產(chǎn)毒，毒素從傷口進入血液循環(huán)而導致，臨床上較少見。

 

    肉毒中毒的實驗室診斷和定型主要是依據(jù)肉毒毒素、病原菌的檢出，在此基礎(chǔ)上進行產(chǎn)毒試驗和診斷血清的中和試驗。按GB／T4789.12-2003的方法規(guī)定要求，一個在流行病學調(diào)查和臨床診斷上已明確的食物中毒，其樣品在實驗室的確診上所需的zui少時間是10天。