電轉(zhuǎn)化連接物構(gòu)建抗體文庫

[方法]
1．將電轉(zhuǎn)化儀設(shè)置為200D（電阻）、25rtF（電容）和2．5kV。
2．在冰上復(fù)溶電感受態(tài)細(xì)菌或使用新鮮制備的電感受態(tài)細(xì)胞。將電轉(zhuǎn)化杯、杯固定夾、細(xì)胞和DNA均放于冰上。
3．將80ng已純化且無鹽的DNA與50g1細(xì)菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。
4．將混合物轉(zhuǎn)移至0．2cm間距的電轉(zhuǎn)化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉(zhuǎn)移以使小杯處于低溫狀態(tài)。
5．將透明杯放入電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，確保小杯側(cè)面干燥（以免電弧）。啟動(dòng)脈沖，立即加入1．0ml SOC培養(yǎng)基并混合。時(shí)間恒定值應(yīng)在4．5～5．5毫秒范圍之間。如果時(shí)間恒定值小于4．3秒，則重復(fù)DNA沉淀。
6．在每次電轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌中加入lmlSOC培養(yǎng)基，以250r/min振蕩培養(yǎng)，37℃1小時(shí)。
7．合并所有電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液，系列稀釋后在100mm TYE/amp/glu平板上鋪板確定文庫容量。
8．以200g、4℃10分鐘離心剩余的細(xì)菌培養(yǎng)液。將每4次電轉(zhuǎn)化的沉淀重懸于500u1的體積。以每份125ul等量體積分別鋪于150mmTYE/amp/glu平板上或?qū)?00ul鋪于含TYE/amp/glu的Nunclon quare ishes500cm2。將這些平板在30℃下培養(yǎng)過夜。
9．加入10m1含15%甘油（0．2gm濾膜過濾除菌）的TYE/amp/glu培養(yǎng)基；刮取平板上的細(xì)菌。在-70℃下儲存抗體文庫。

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