篩選解離速率優(yōu)化的scFv

[方法]
1．每個克隆用lml 2XTY／amp／S1u 30~C培養(yǎng)過夜，250r／min振蕩。
2．取50u1過夜培養(yǎng)物，加入到含有5ml 2XTY／amp／0．1％glu的50ml試管內(nèi)；并在30℃培養(yǎng)大約2小時，250r／Illin振蕩，吸光度（A600）大約0．9。
3．每管加入2．5ul lmol／LIPTG誘導(dǎo)scFv表達（終濃度為500umol／L），并在30℃培養(yǎng)4h，250r／min振蕩。在1個15ml Falcon試管內(nèi)4000g離心15分鐘，收集細(xì)胞。
4．準(zhǔn)備外周質(zhì)提取物。用200u1 PPB緩沖液重懸細(xì)菌沉淀，將沉淀懸液轉(zhuǎn)移到1．5m1試管內(nèi)，放于冰上20分鐘；這會使細(xì)胞皺縮并提取部分scFv蛋白；加入低滲性MgCl2使外周質(zhì)處于高滲狀態(tài)促進腫脹。用微型離心機沉淀細(xì)胞，6000r／min 5分鐘。棄去上清。細(xì)菌沉淀部分將用于滲透壓休克的制備。
5．準(zhǔn)備滲透壓休克組分。用200u1 5mm01／L MgSO4重懸沉淀并在冰上孵育重懸沉淀物20分鐘。用微型離心機全速（14000r／min）離Jc沉淀細(xì)胞5分鐘。取1支新試管保存上清，即為滲透壓休克組分。
6．用CentriSep柱將含有scFv的滲透壓休克緩沖液換為Blacore運行緩沖液（HBS），操作按廠家所述進行。
7．根據(jù)廠家說明書裝配Biacore儀。在Biacore儀流動池內(nèi)，用EDC／NHS化學(xué)法將靶抗原固化在CM5傳感芯片上，操作按廠家所述進行。
8．將步驟5所制備的scFv樣品注入到流動池內(nèi)，1分鐘。而后，保持15u1／min的恒定流速，用HBS作為運行緩沖液，觀察解離相2一10分鐘。
9．再生芯片的表面，并進行下一個scFv分析。可以編寫程序使此過程自動進行，使40～50個scFv的數(shù)值能自動進行過夜分析。使用Biacore廠家提供的軟件，可對每個所分析的scFv自其感應(yīng)圖的解離部分測定出表觀κoff值。
經(jīng)過上述分析后，就能根據(jù)Aof／值高低將克隆依次排列。然后，純化解離速率zui低的scFv并測定其Kd值。這種載體附加了C末端六組氨酸標(biāo)簽，因此，用固相金屬親和層析（IMAc）從外周質(zhì)中純化出scFv。而這對于那些在已含有六組氨酸標(biāo)簽的噬菌體展示載體中的克隆來說，卻無必要。而后，用膠過濾方法去除凝集的和二聚化的scFv，用BIAcore儀進行SPR測定κon值和Aoff值，再以此計算出Kd值。

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