凝膠電泳前的蛋白質(zhì)烷化

 

    1．如果使用經(jīng)免疫沉淀法得到的蛋白，按常規(guī)洗滌免疫復(fù)合物。盡可能*去除zui后的洗液。如果使用其他來源的蛋白，則將其轉(zhuǎn)入20mmol／L的磷酸鹽溶液中(pH7．0)，或直接在20／1l水中重懸蛋白。蛋白濃度應(yīng)低于lmg／m1。

 

    2．加入20u1．5％SDS和20mmol／L DTI。

 

    3．加熱至85C10min，仔細(xì)將上清液移入另一試管。

 

    4．加入10rd新鮮配制的0．2mmol／LN-乙基順了烯二酰亞胺(NEM)，12．5mg／m1的水溶液為飽和溶液)，使用前臨時(shí)配制。85℃溫育10min，有利于NEM溶于溶液中。超聲水浴亦可起作用，但是重復(fù)抽吸即足以促溶。由于溶液是飽和的，*液化不可能。另外，可將NEM溶于20retool／L乙酸鈉中(pH 6．0)。

 

    5．置冰浴中60min。

 

    6．加入10ul 50％甘油，0．5mol／lp-巰基乙醇和0．001％的溴酚藍(lán)。

 

    至此樣品可以進(jìn)行電泳。