對(duì)于組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞，zui有效的裂解方法是用去污劑進(jìn)行處理。雖然有多種去污劑可用于裂解細(xì)胞，但zui常用的是TritonX—100或NP—40等非離子型去污劑。非離子型去污劑能溶解胞質(zhì)和細(xì)胞膜，破壞分子間許多微弱的結(jié)合鍵，并能溶解大部分經(jīng)常研究的蛋白質(zhì)抗原，但對(duì)于大分子多聚抗原則無(wú)效，在大多數(shù)情況下該抗原也是難以研究的。濃度介于0．1％～1％的去污劑即可滿足幾乎所有溶解需求。非離子型去污劑裂解液一般補(bǔ)充等離子濃度的鹽和接近中性的pH。
在某些情況下，需要較劇烈的抽提條件以釋出所研究的抗原或除去微弱的相關(guān)蛋白。此時(shí)，推薦使用RIPA裂解緩沖液，該體系含離子型和非離子型去污劑，具有相當(dāng)大的變性能力。除細(xì)胞內(nèi)不溶性蛋白外所有可溶性蛋白分子均可釋出，并能破壞大部分非共價(jià)的相互作用。
除非有特殊原因，推薦在裂解緩沖體系中加入蛋白酶抑制劑混合液。在新抗原研究的早期使用蛋白酶抑制劑總是有利的。在該蛋白已被定性后，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以了解這些抑制劑是否在所有情況下都必需。如前所述，終止蛋白酶作用的方法是在免疫沉淀的全部過(guò)程中溶液保持低溫。
如果研究經(jīng)磷酸化修飾的
蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)考慮加入磷酸酶抑制劑。
1．準(zhǔn)備工作
由于免疫沉淀有多個(gè)步驟，且包括數(shù)小時(shí)孵育，因此在實(shí)驗(yàn)開始前必須安排好時(shí)間，注意適當(dāng)利用過(guò)夜孵育的時(shí)間間隔。這將有助于決定何時(shí)開始裂解細(xì)胞。
2．所需溶液
PBS，裂解緩沖液（4℃預(yù)冷）。
3．操作步驟
（1）單層細(xì)胞的培養(yǎng)，用室溫PBS洗細(xì)胞一次，然后甩干；懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，400g離心10min，收集細(xì)胞棄上清液。
（2）對(duì)于單層細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)瓶置于冰上，每lOOmm培養(yǎng)瓶加入1 mL溶解緩沖液（4℃預(yù)冷）；對(duì)于懸浮培養(yǎng)，將盛細(xì)胞團(tuán)的試管置于冰上。按107個(gè)細(xì)胞加入1．0ml裂解液（4℃預(yù)冷）。
保存在冰箱的裂解液可隨時(shí)使用。
（3）冰上放置3min，不時(shí)敲擊貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶，或輕搖懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。
（4）對(duì)于單層細(xì)胞培養(yǎng)，敲擊培養(yǎng)瓶數(shù)次，混合均勻，在冰床上傾斜培養(yǎng)瓶使溶液集中于一側(cè)，然后將裂解物移置另一支1．5mL圓錐形試管。有些研究者喜歡從瓶壁刮取細(xì)胞，但除特殊要求外此舉并非必須。
（5）單層培養(yǎng)的細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞均以10 000g，413離心10min，仔細(xì)吸取上清液盛于另一試管，不可攪動(dòng)細(xì)胞團(tuán)。置冰上。
此時(shí)，上清液可用于下一步的預(yù)處理。
4．常見問(wèn)題
上述程序zui普遍的問(wèn)題是抗原不*從細(xì)胞內(nèi)釋放。可以通過(guò)對(duì)裂解液和細(xì)胞殘?jiān)M(jìn)行免疫印跡來(lái)檢查抗原是否*釋放。改變裂解液所用的去污劑是增加抗原釋放的zui有效方法。
機(jī)械性剪切也可破壞細(xì)胞膜，常見的方法包括使用超聲波發(fā)生器、Dounce勻漿器、波特器和攪拌器等。這些方法特別適用于大體積制備或需避免使用去污劑時(shí)。在這些方法中，zui溫和的方法是使用Dounce勻漿器，但僅適合于較大體積的標(biāo)本（數(shù)毫升或更多）。
一般不推薦凍融法，因反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)過(guò)量降解，其原因不明。除非所研究的抗原特別能耐受蛋白水解作用或者事先已測(cè)試過(guò)該方法，一般不作為。通常，用去污劑裂解是免疫沉淀的方法。
更新時(shí)間：2012-10-08
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