裂解酵母菌的方法是將玻璃微珠和菌細(xì)胞一起渦旋振蕩進(jìn)行機(jī)械破碎。此法充分利用玻璃微珠的快速轉(zhuǎn)動(dòng)撞擊酵母菌從而機(jī)械破碎裂解酵母細(xì)胞。由此可見，這是一種強(qiáng)有力的裂解方法，但在裂解過程中又傳輸大量的能量，導(dǎo)致樣本的變性。因此，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究比較，酵母菌的免疫沉淀試驗(yàn)并不是一個(gè)好的方法，特別是研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)時(shí)，該方法是不可取的。
1．準(zhǔn)備工作
由于免疫沉淀有多個(gè)步驟，且包括數(shù)小時(shí)孵育，因此在實(shí)驗(yàn)開始前必須安排好時(shí)間，注意適當(dāng)利用過夜孵育的間隙。這將有助于決定何時(shí)開始裂解細(xì)胞。同時(shí)應(yīng)注意，
酵母菌免疫沉淀的本底水平非常高，因此推薦進(jìn)行預(yù)處理和使用蛋白酶。
2．所需溶液
PBS，裂解緩沖液（含有蛋白酶抑制劑，置冰上預(yù)冷），玻璃微珠（500umol／L，冷藏）。
3．操作步驟
（1）4000g離心5min收集酵母菌，去上清液。重懸浮于PBS，離心，棄去PBS。
（2）將酵母團(tuán)再次懸浮于少量預(yù)冷的裂解液。通常用大約3倍體積的RIPA緩沖液（150mmol／L NaCl、1％NP-40、0．5％脫氧膽酸鈉、0．1％SDS和50mmol／L Tris，pH8．0）。同時(shí)應(yīng)加入蛋白酶抑制劑。置冰上。
（3）玻璃微珠（直徑500~mol／L），用1mol／I鹽酸和裂解緩沖液分別洗滌2次。然后置于少量裂解緩沖液內(nèi)，413保存。
（4）在重懸浮的酵母細(xì)胞內(nèi)加入等體積預(yù)冷的玻璃微珠。
（5）劇烈渦流振蕩30s，重復(fù)操作直至大部分酵母細(xì)胞裂解。
（6）將細(xì)胞裂解物連同玻璃微珠以10 000g離心5min。仔細(xì)吸取上清液盛于另一試管，置冰上。
此時(shí)，上清液可以用于下一步預(yù)處理。
4．常見問題
該方法常見問題是
蛋白質(zhì)抗原的變性。解決方法是用某些能破壞細(xì)胞壁的酶處理酵母菌使其形成原生質(zhì)體，然后再用去污劑將其裂解。這是一個(gè)有效的方法，但酶的價(jià)格昂貴，限制了該方法常規(guī)應(yīng)用于大容量標(biāo)本的制備。然而對于所研究的關(guān)鍵蛋白的精細(xì)分析，仍不失為一個(gè)有效的方法。
更新時(shí)間：2012-10-08
點(diǎn)擊次數(shù)：2279
當(dāng)前位置：
