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    蛋白質(zhì)定量分析

    更新時(shí)間:2012-07-16點(diǎn)擊次數(shù):1241

    Bradford 的dye-binding method 是利用Coomassie brilliant blue G-250 (CBG) 可與蛋白質(zhì)結(jié)合而變色的特性來定量 (Bradford, 1976);若試樣中的蛋白質(zhì)量較多,則結(jié)合到蛋白質(zhì)而變色的CBG 也多,因而呈色較深。下例是以一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為對象,制作一條蛋白質(zhì)量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)校正線。

    儀器用具:ELISA光度計(jì) (Dynatech) 可在一分鐘內(nèi)測完一片滴定盤微量滴定盤 (microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404)Micro test tubes, 大頭針或噴火槍
    藥品試劑:(a) Buffer A-0(b) BSA標(biāo)準(zhǔn)品 (Bio-Rad, bovine serum albumin, 100 μg/mL)(c) 未知濃度樣本 (unknown BSA, 0.8 mL, 由教師調(diào)配發(fā)給)(d) Dye Reagent (Bio-Rad 500-0006) 先以水稀釋四倍備用。 以染料Coomassie brilliant blue G-250 配制的溶液,勿與膠體電泳染色用的CBR-250 混淆,各有其使用上的特色,不要互用。
        標(biāo)準(zhǔn)品及樣本:
        標(biāo)準(zhǔn)品系列:使用小試管準(zhǔn)備一組BSA (b) 標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋:
        ◆ 配制一定要精準(zhǔn),否則校正直線不會很準(zhǔn)確;各種試劑的添加,若自稀往濃取樣,則可以不用換吸管頭。
        未知樣本:再以上述unknown BSA (c) 準(zhǔn)備兩種未知樣本:Label 未知樣本 (c) Buffer A-0 Final Conc.
        一般樣本:1) 通常由色析法所收集到的各分劃樣本,都可以直接進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析;但若其中含有某些干擾因子 (如含有Triton),或樣本的濃度太濃,都必須將樣本稀釋后再測。2) 同一樣本的若干不同稀釋濃度,所測出來的zui終蛋白質(zhì)濃度會有差異,通常是以稀釋度大者較為準(zhǔn)確。
        方法步驟:
    1)   每槽先加好50 μL標(biāo)準(zhǔn)品 (#0, #1 .... #5) 或未知樣本 (X1, X2),以二重復(fù)加入96 孔滴定盤中,如圖所示。
    微量滴定盤的使用
    2) 每槽再加入200 μL Dye-Reagent (d),在全部樣本槽加完前,不要中斷添加;同時(shí)小心避免氣泡產(chǎn)生。
    3) 輕拍滴定盤一側(cè),使添加的各成份均勻混合,注意Dye-Reagent 密度較大,很容易沉積在下方而分層。 若還有小氣泡,小心以大頭針刺破,大量時(shí)可用噴火槍火焰燒破。
    4) 靜置室溫10 min。
    5) 以ELISA reader測量570 nm (或595 nm) 的吸光值。
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