蛋白質(zhì)純化膠體過濾法

 

    不同大小的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入膠體過濾管柱，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應(yīng)用的partition色析法 （Pharmacia操作手冊(cè), Gel Filtration）。

 

    儀器設(shè)備：色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；分劃收集器 （fraction collector, 需準(zhǔn)備干凈試管約100 支）；濃縮用離心機(jī) （低速5,000 rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30 （Amicon 4322） 請(qǐng)注意其使用方法

 

    藥品試劑：膠體Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 預(yù)先以緩沖液buffer A-150 平衡好，并且使*沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預(yù)估好膠體的使用量。b. 膠體溫度要與操作場(chǎng)所的溫度一致，否則溫度變化會(huì)產(chǎn)生氣泡。c. Sephacryl 系列膠體有相當(dāng)大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非專一性吸附。Buffer A-150：注意使用時(shí)的溫度要與管柱膠體的溫度一致標(biāo)準(zhǔn)分子量組合 （Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每組取0.4 mL。含有thyroglobulin （670 kD）, bovine gamma globulin （158 kD）, chicken ovalbumin （44 kD）, equine myoglobin （17 kD）, vitamin B12 （1,350）

 

    方法步驟：

 

    管柱裝填：1） 以純水沖洗玻璃管柱 （以純水上下沖洗即可，嚴(yán)禁使用試管刷）；并請(qǐng)了解管柱的構(gòu)造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接分劃收集器，并以bufferA-150 試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長(zhǎng)尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進(jìn)行。 注意系統(tǒng)的擺設(shè)要適當(dāng)，不要裝置于交通要沖。2） 依預(yù)估量取出Sephacryl 膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震蕩，使的*懸浮，但勿產(chǎn)生太多氣泡。3） 在管柱內(nèi)加入約10 cm 高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開始流洗后膠體沈降很快。當(dāng)膠體上方的液面逐漸降低時(shí)，可于頂端添加膠體，以達(dá)所要高度；膠體高度約90 cm。4） 膠體*沈降后，小心以buffer A-150 加滿管柱，關(guān)閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗。 調(diào)整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，并設(shè)定收集體積為2.5 mL/tube。5） 膠柱流洗約100 mL 后，關(guān)閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1 cm 高，注意勿破壞膠體表面平整； 然后打開出口，使液面下降至膠體面，再關(guān)閉出口，準(zhǔn)備注入樣本。

 

    樣本色析進(jìn)行：6） 以微量移液器或滴管吸取樣本 （樣本體積不得超過膠體總體積的3%），沿著膠體上方管壁緩慢加入，注意切勿破壞膠體的平整表面！（樣本確實(shí)體積 _______ mL）7） 打開出口，同時(shí)開啟分劃收集器；當(dāng)樣本*沒入膠體時(shí)，關(guān)閉出口，緩緩加入與樣本相等體積的buffer A-150，打開出口待其慢慢進(jìn)入膠體中，如此重復(fù)二次。不得擾動(dòng)膠體表面，造成凹陷。8） 暫時(shí)關(guān)閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端，并把頂端端蓋鎖上；然后打開出口開始溶離，調(diào)整緩沖液瓶的高度，使流速為6 s 一滴。9） 要留心觀察前面幾個(gè)分劃，確定整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)無礙，小心分劃收集器zui容易出問題。管柱預(yù)計(jì)將流洗過夜，收集約80 管。10） 收集分劃試管，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析以及GUS 活性測(cè)定，并請(qǐng)作圖。11） 收集GUS 活性區(qū)，以Centriprep-30 濃縮至10 mL 后，加buffer A-0 稀釋至20 mL，再次濃縮至 _______ mL （GF），保留100 μL。12） 管柱請(qǐng)?jiān)僖詁uffer A-150 流洗100 mL 后，小心放置一旁，準(zhǔn)備以后進(jìn)行分子量測(cè)定。

 

    分子量測(cè)定：13） 進(jìn)行分子量測(cè)定前一天，請(qǐng)先以buffer A-150 流洗100 mL，并檢查膠柱內(nèi)有無氣泡產(chǎn)生，若有嚴(yán)重的氣泡或干裂，必須重新裝填管柱。14） 取標(biāo)準(zhǔn)分子量溶液0.4 mL，加上純質(zhì)目標(biāo)酶0.5 mL （以親和層析法所得的AF 部份），如上法注入管柱中，立刻開始進(jìn)行膠體過濾，并收集各分劃。請(qǐng)依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點(diǎn)。15） 收集所得的各分劃，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析，可定出數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)尖峰，以作為分子量依據(jù)；另以目測(cè)法，決定紅色高峰的管數(shù)，則可定出vitamin B12的溶離管數(shù)。利用以上數(shù)據(jù)，可畫出分子量與溶離管數(shù)間的直線關(guān)系，作為分子量判定的標(biāo)準(zhǔn)校正線。16） 同樣的一批分劃，請(qǐng)進(jìn)行酶活性分析 （GUS），則可定出酶的溶離體積，對(duì)照上述標(biāo)準(zhǔn)校正線，則可求出酶的分子量。

 

    拆除管柱及保存膠體：17） 若管柱長(zhǎng)期不用，應(yīng)當(dāng)自管柱中取出膠體，以緩沖液清洗后，置冷藏室中保存，但不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊，有時(shí)可能不易取出，要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來。18） 膠體可以加0.01% NaN3防止霉菌生長(zhǎng)，但使用前記得要洗去；再度使用時(shí)，請(qǐng)檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒，若有結(jié)塊而不易打散者，也不要使用。