抗體標記直接法和間接法的選用

很多免疫學技術依賴于標記抗體的使用。對抗體進行標記主要是用于抗原的定位分析，在某些情況下，也可以對混雜有大量其他分子的樣本中的抗原進行定量檢測。由于抗體與其相應抗原具有很高的親和力，因此帶有易識別標記物的抗體可以定位分析抗原，并且是一種理想的快速價廉的定量測定方法。需要使用標記抗體的三種方法，即免疫染色法、免疫印跡法和免疫分析。此三種方法均能定位復雜混合物中的抗原，而且通過適當的對照也能定量測定。就免疫染色法而言，其目的就是定位正常細胞環(huán)境中出現的抗原。在此背景下，所有抗原均...

凝膠電泳前的蛋白質烷化

1．如果使用經免疫沉淀法得到的蛋白，按常規(guī)洗滌免疫復合物。盡可能*去除zui后的洗液。如果使用其他來源的蛋白，則將其轉入20mmol／L的磷酸鹽溶液中(pH7．0)，或直接在20／1l水中重懸蛋白。蛋白濃度應低于lmg／m1。2．加入20u1．5％SDS和20mmol／LDTI。3．加熱至85C10min，仔細將上清液移入另一試管。4．加入10rd新鮮配制的0．2mmol／LN-乙基順了烯二酰亞胺(NEM)，12．5mg／m1的水溶液為飽和溶液)，使用前臨時配制。85℃溫育1...

用多聚甲醛固定懸浮細胞

所有的固定方案必須做到：①防止抗原丟失；②透化細胞以便使抗體進入；③盡量使抗原保持能與抗體結合的狀態(tài)；④維持細胞正常結構。常用的固定劑種類很多，固定劑的正確選擇取決于被研究抗原的性質及所用抗體的特性。固定劑可分為兩大類：有機溶劑和交聯(lián)劑。有機溶劑如乙醇和丙酮能夠去除脂類物質使細胞脫水，把蛋白質沉淀在細胞結構上。交聯(lián)劑一般通過自由氨基基團把生物分子橋連起來，形成一個相互連接的抗原網。兩種方法均使蛋白質抗原部分變性。因此，在細胞染色中，能夠識別變性蛋白的抗體更加有用。在某些情況下...

免疫親和純化的操作步驟

1．主要內容純化率為1000～10000倍?？焖偌兓乖?，層析柱常可重復使用?？色@得純化的抗原。不能用于定量測定。純化效果取決于抗原的濃度和抗體的親和力需要適當純化的抗體。2．操作步驟(1)將抗體結合到蛋白A或蛋白G微珠上。對于一般用途的層析柱，每毫升濕的微珠大約可以結合2mg單克隆抗體或親和純化的多克隆抗體。將抗體和蛋白A或蛋白G微珠混合制成稀薄的勻漿，在總量為10ml的溶液中加入大約lml微珠，室溫孵育1h，輕輕搖動混勻。(2)用10倍體積的0．2mol／L硼酸鈉(pH9...

為何使用標記蛋白

標記蛋白具有許多優(yōu)點。原則上，該方法為檢測各種細胞成分中感興趣的蛋白提供廠新的手段。①如果開放閱讀框已經被克隆化，但是由于蛋白是新發(fā)現的，或者由于蛋白免疫原性較弱，目前尚沒有針對該蛋白產物的抗體時，此標記技術具有重要的應用價值。隨著基因組的研究，由基因工程進入蛋白工程，標記技術顯得越來越重要。②由于標記物不是天然蛋白氨基酸序列的固有部分，與標記物結合的試劑在進行蛋白提純過程中，對蛋白功能產生影響的可能性較小。③只要具備適當的載體，標記蛋白可在任何細胞中進行表達；例如，相同的標...

Real-Time PCR

所謂Real-TimePCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。real-timePCR技術即實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產物監(jiān)測定量產生的偏差，提高實驗的重復性。該技術已經被廣泛用于監(jiān)測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因...

探秘云南轉基因克隆豬 神奇熒光助推人類醫(yī)學研究

摘要：云南農業(yè)大學動物科學技術學院近日成功育成10頭攜帶綠色熒光蛋白和瘦素蛋白的轉基因克隆豬引起各界廣泛關注，2月3日記者在云南農業(yè)大學了解到，這一成果將有助于脂肪沉積以及人類肥胖病和糖尿病等疾病的研究，也將使轉基因克隆技術在功能基因驗證、疾病模型、異種器官移植等領域的應用前景更為廣闊。云南農業(yè)大學動物科學技術學院近日成功育成10頭攜帶綠色熒光蛋白和瘦素蛋白的轉基因克隆豬引起各界廣泛關注，2月3日記者在云南農業(yè)大學了解到，這一成果將有助于脂肪沉積以及人類肥胖病和糖尿病等疾病的...